Внутрішньолабораторна апробація протоколу ПЛР для молекулярно-генетичної ідентифікації бактерій роду Staphylococcus spp.

Abstract

Наведені результати оптимізації протоколу ідентифікації бактерій Staphylococcus spp. методом полімеразної ланцюгової реакції з детекцією в агарозному гелі та апробації протоколу з польовими штамами відібраними від собак. Визначення параметрів специфічності та чутливості методу проводили на музейних штамах коків S. epidermidis АТСС 14990, S. aureus АТСС 25923, S. aureus subsp. aureus УКМ В-918, S. pneumoniae ATCC 49619 та E. faecalis ATCC 194433. Екстракцію ДНК проводили за допомогою набору IndiSpin Pathogen Kit. Для виготовлення реакційної суміші використали готовий ПЛР мікс NEB OneTaq® 2X Master Mix with Standard Buffer. Для дослідження використовували праймери націлені на ділянку гена tuf, що дають продукт ампліфікації 370 bp. Облік результатів реакції проводили в 2 % агаровому гелі з додаванням етидіум броміду у концентрації 0,5 %. Оптимальну температуру відпалу визначали методом градієнта температур. За дослідження специфічності методики три музейні штами стафілококів були ідентифіковані як позитивні, тимчасом штами інших коків не дали продуктів реакції. Дослідження чутливості методу полягало у виявленні продукту ампліфікації в семи розведеннях бактеріальної суспензії, що відповідають стандартам каламутності McFarland, найменша концентрації була додатково розведена у 10, 100 та 1000 разів. Останнє розведення, що показало наявність продукту ампліфікації відповідає 2×106 КУО в 200 мкл фізіологічного розчину, що використовували для виділення ДНК. Апробацію протоколу ПЛР проведено на польових штамах стафілококів. Для дослідження були відібрані вушні і назальні мазки у собак, а також змиви з клітки-переноски. Первинний посів матеріалу був проведений на маніт-сольовий агар, на цьому середовищі можливий ріст лише галофільних мікроорганізмів. Було виявлено ріст на 17 чашках Петрі. Дослідження змивів з цих чашок методом ПЛР вказало на наявність стафілококів у досліджуваних матеріалах. Результати внутрішньолабораторної апробації ПЛР вказують на те, що використаний нами праймер дає високі показники параметрів специфічності та чутливості. Апробована нами методика може бути використана для підтвердження наявності бактерій Staphylococcus spp. в первинному посіві мазків відібраних від собак.