Advancing recovery and cryopreservation of rat spermatogonia for germ stem cell banking

Abstract

Aim. Optimisation of spermatogonial cryopreservation medium and spermatogonia recovery procedures essential for the male germ cell research and spermatogonia mediated transgenesis in rodents. Methods. PCR, LIVE/DEAD® Cell Viability Assays, Spermatogonial Colony Forming Assay, immunocytochemistry, cryopreservation and thawing spermatogonia cells. Results. Three Sleeping Beauty mutant spermatogonia stem cell lines were stored in liquid nitrogen, after 17–24 months of cryopreservation, were derived in parallel from recovered cryopreserved cultures via an established laminin selection procedure and by an alternative method termed as direct SG (Spermatogonia Growth) medium selection on MEFs (mouse embrionic fibroblasts). A spermatogenic potential of the cell lines derived by these two methods was verified by the spermatogonia transplantation in vivo and reestablishing the mutant animal lines. We optimized the concentration of DMSO in a freezing medium for spermatogonial cell lines. Conclusions. We developed and optimized recovery of spermatogonial stem cells, that could be consistently derived from the freshly thawed stocks of testicular cells cryopreserved in SG medium. Our data suggest that the 8 % DMSO is the most effective concentration of the cryoprotectant in SG medium.Оптимизировать раствор для криоконсервации сперматогонии и процедуру её восстановления. Методы. ПЦР, Тест на выживаемость клеток, Тест на формирование сперматогональных колоний, иммуноцитохимия, криоконсервация и размораживание сперматогонии. Результаты. Три мутированные сперматогональные стволовые клеточные линии Спящая Красавица после 17–24 месяцев криоконсервации были восстановлены двумя методами: традиционным — с применением ламининовой селекции и новым методом селекции сперматогональных стволовых клеток (ССК) в питательной среде на мышиных эмбриональных фибробластах. Мутированные линии ССК, восстановленные двумя способами, трансплантировали в семянники самцов-реципиентов. Было получено трансгенное потомство. Мы усовершенствовали концентрацию диметилсульфоксида (ДМСО) в растворе для замораживания линий ССК. Выводы. После выделения ССК из семянников крыс и длительного криосохранения, оптимизированная процедура восстановления их в питательной среде позволяет успешно получать трансгенных животных из банка мутированных линий ССК. Наши результаты доказывают целесообразность включения 8 % ДМСО в состав питательной среды для ССК с целью криоконсервации